BIOLOGY IS ALL

今世为人，俯仰于天地之间，当探求宇宙之奥秘，精研物种之万象，追踪溯源，后知衍变之趋势。虽活百年，亦可知千万年之事也。

吾乃小粟，存于沧海之中，不求闻达于诸侯，不贪功名利禄，但求以己之力，窥天道之一隅，方此生无憾。然世道艰险，此小愿似唾手可得，却又隔千山万水。吾乃知难而退之人，料此生无大作为，唯此事必坚持到底，赌我一生之光阴无悔。

一、实验目的： 免疫印迹主要用于蛋白质的结构和活性检测等方面，学生掌握与免疫印迹相关的原理和方法，如电泳技术，转膜技术等。 二、实验原理：      蛋白质印迹(Western blotting)是将蛋白质转移并固定在化学合成膜的支撑物上，然后以特定的亲和反应、免疫反应或结合反应及显色系统分析此印迹。      蛋白质印迹(免疫印迹)的实验包括5个步骤：1)固定(immobilization)：蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)并从胶上转移到硝酸纤维素膜上。2)封闭(blocked)：保持膜上没有特殊抗体结合的场所，使场所处于饱和状态，用以保护特异性抗体结合到膜上,并与蛋白质反应。3)初级抗体(第一抗体)是特异性的。4)第二抗体或配体试剂对于初级抗体是特异性结合并作为指示物。5)适当保温后的酶标记蛋白质区带，产生可见的、不溶解状态的颜色反应。 三、    试剂与器材： 试剂: (1)人IgG免疫兔的抗血清； (2)辣根过氧化酶一羊抗兔IgG； (3)PBS缓冲液：NaCl 8 g，KCl 0.2 g，KH2P04 O．24 g，Na2HP04·12H20 2.9 g，加蒸馏水至1000 ml，pH值为7.4； (4)PBS-T缓冲液：PBS缓冲液加O.05 9／6 Tween-20； (5)封闭液：0.5％(质量分数)BSA(用PBS缓冲液配制)； (6)底物溶液：      A液：溶解30 mg CN在5 ml甲醇中；      B液：溶解10 mg DAB在5 ml甲醇中；      C液：分别搅拌A液和B液10～15 rain，直到完全溶解，然后将A液和B液混合，加PBS至50 ml，分成10 ml一份，不用的可冷冻(一20~C)(下次直接化冻运用)；      D液：取10 ml C液，运用时加10 ml 30％(体积分数)H202； (7)转移缓冲液：0.025 mol／L Tris，O．192 mol／L甘氨酸(glycine)，20％(体积分数)甲醇(methan01)，pH值为8.3。    器材:   (1)半干转移槽；    (2)电泳仪电源：直流稳压，500 V，150 mA。 四、操作方法： 1、SDS-PAGE     将待检测的抗原粗提取液、纯化过程中的样品或纯化后的样品以及标准相对分子质量蛋白质等用SDS-PAGE分离。 2、转移蛋白质到硝酸纤维素薄膜上 (1)准备转移缓冲液。 (2)切割与胶尺寸相符的硝酸纤维素薄膜，并用转移缓冲液浸湿，放置15 min直到没有气泡。 (3)切割8张普通滤纸，其大小与胶尺寸大小相符，并将其浸泡在有转移缓冲液的培养皿中(与硝酸纤维素薄膜分开浸泡)。 (4)电泳后，切取有用部分的胶，并很快地在转移缓冲液中洗涤。 (5)打开蛋白质转移槽的盖板，依次放入：   ①4张用转移缓冲液浸泡过的滤纸；   ②用转移缓冲液洗过的胶，并小心地赶走滤纸和胶之间的所有气泡；   ③放上硝酸纤维素膜；   ④另4张用转移缓冲液浸泡过的滤纸； (6)小心地合上转移槽的盖板； (7)插入电极，注意正负极方向(硝酸纤维素膜面向阳极)，打开电泳仪开关，调至胶的面积(cm2)×O．8 mA，1．5～2 h。 (8)转移结束后打开盖板取出硝酸纤维素薄膜。 3、免疫印迹膜的处理   (1)用PBS缓冲液洗膜5～10 rain。    (2)将膜用封闭溶液封闭，用摇床轻摇(37℃)60 rain。    (3)用PBS缓冲液洗膜3次，每次10 rain。    (4)将膜置于第一抗体溶液(小牛血清免疫兔的抗血清，1：10)中，置摇床上轻摇，37℃摇动2 h或4℃过夜。 一、实验目的： 免疫印迹主要用于蛋白质的结构和活性检测等方面，学生掌握与免疫印迹相关的原理和方法，如电泳技术，转膜技术等。 二、实验原理：      蛋白质印迹(Western blotting)是将蛋白质转移并固定在化学合成膜的支撑物上，然后以特定的亲和反应、免疫反应或结合反应及显色系统分析此印迹。      蛋白质印迹(免疫印迹)的实验包括5个步骤：1)固定(immobilization)：蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)并从胶上转移到硝酸纤维素膜上。2)封闭(blocked)：保持膜上没有特殊抗体结合的场所，使场所处于饱和状态，用以保护特异性抗体结合到膜上,并与蛋白质反应。3)初级抗体(第一抗体)是特异性的。4)第二抗体或配体试剂对于初级抗体是特异性结合并作为指示物。5)适当保温后的酶标记蛋白质区带，产生可见的、不溶解状态的颜色反应。 三、    试剂与器材： 试剂: (1)人IgG免疫兔的抗血清； (2)辣根过氧化酶一羊抗兔IgG； (3)PBS缓冲液：NaCl 8 g，KCl 0.2 g，KH2P04 O．24 g，Na2HP04·12H20 2.9 g，加蒸馏水至1000 ml，pH值为7.4； (4)PBS-T缓冲液：PBS缓冲液加O.05 9／6 Tween-20； (5)封闭液：0.5％(质量分数)BSA(用PBS缓冲液配制)； (6)底物溶液：      A液：溶解30 mg CN在5 ml甲醇中；      B液：溶解10 mg DAB在5 ml甲醇中；      C液：分别搅拌A液和B液10～15 rain，直到完全溶解，然后将A液和B液混合，加PBS至50 ml，分成10 ml一份，不用的可冷冻(一20~C)(下次直接化冻运用)；      D液：取10 ml C液，运用时加10 ml 30％(体积分数)H202； (7)转移缓冲液：0.025 mol／L Tris，O．192 mol／L甘氨酸(glycine)，20％(体积分数)甲醇(methan01)，pH值为8.3。    器材:   (1)半干转移槽；    (2)电泳仪电源：直流稳压，500 V，150 mA。 四、操作方法： 1、SDS-PAGE     将待检测的抗原粗提取液、纯化过程中的样品或纯化后的样品以及标准相对分子质量蛋白质等用SDS-PAGE分离。 2、转移蛋白质到硝酸纤维素薄膜上 (1)准备转移缓冲液。 (2)切割与胶尺寸相符的硝酸纤维素薄膜，并用转移缓冲液浸湿，放置15 min直到没有气泡。 (3)切割8张普通滤纸，其大小与胶尺寸大小相符，并将其浸泡在有转移缓冲液的培养皿中(与硝酸纤维素薄膜分开浸泡)。 (4)电泳后，切取有用部分的胶，并很快地在转移缓冲液中洗涤。 (5)打开蛋白质转移槽的盖板，依次放入：   ①4张用转移缓冲液浸泡过的滤纸；   ②用转移缓冲液洗过的胶，并小心地赶走滤纸和胶之间的所有气泡；   ③放上硝酸纤维素膜；   ④另4张用转移缓冲液浸泡过的滤纸； (6)小心地合上转移槽的盖板； (7)插入电极，注意正负极方向(硝酸纤维素膜面向阳极)，打开电泳仪开关，调至胶的面积(cm2)×O．8 mA，1．5～2 h。 (8)转移结束后打开盖板取出硝酸纤维素薄膜。 3、免疫印迹膜的处理   (1)用PBS缓冲液洗膜5～10 rain。    (2)将膜用封闭溶液封闭，用摇床轻摇(37℃)60 rain。    (3)用PBS缓冲液洗膜3次，每次10 rain。    (4)将膜置于第一抗体溶液(小牛血清免疫兔的抗血清，1：10)中，置摇床上轻摇，37℃摇动2 h或4℃过夜。    (5)去掉第一抗体溶液，并用PBS洗膜3次，每次10 min。    (6)将膜置于辣根过氧化酶一羊抗兔IgG溶液(1：500)中，37℃轻摇2 h。    (7)去掉辣根过氧化酶一羊抗兔IgG溶液，并用PBS-T洗膜3次，每次10 min。    (8)最后用PBS溶液洗，以转移Tween-20。    (9)加底物溶液反应2～10 rain，至抗原区带显色清楚为止。    (10)用去离子水洗涤，以终止反应。将膜夹在滤纸间，干燥。置暗处保存。      另外，加底物溶液的显色反应，亦可用增强化学发光法(enhanced chemiluminescenceECI。)代替，以增加其灵敏度，即将膜经ECL kits处理后，用放射自显影法在X-光片上留下清晰的图像。    (5)去掉第一抗体溶液，并用PBS洗膜3次，每次10 min。    (6)将膜置于辣根过氧化酶一羊抗兔IgG溶液(1：500)中，37℃轻摇2 h。    (7)去掉辣根过氧化酶一羊抗兔IgG溶液，并用PBS-T洗膜3次，每次10 min。    (8)最后用PBS溶液洗，以转移Tween-20。    (9)加底物溶液反应2～10 rain，至抗原区带显色清楚为止。    (10)用去离子水洗涤，以终止反应。将膜夹在滤纸间，干燥。置暗处保存。      另外，加底物溶液的显色反应，亦可用增强化学发光法(enhanced chemiluminescenceECI。)代替，以增加其灵敏度，即将膜经ECL kits处理后，用放射自显影法在X-光片上留下清晰的图像。

 

基因表达 RT-PCR之我见

 

本文讨论的范围包括RNA酶保护分析，northernblot，原位杂交，半定量RT-PCR和定量RT-PCR。本文不谈具体protocol，是因为各种书籍和kit说明书上都有，主要说一些原则，而且大部分是失败和成功的经验，还有小组讨论结果以及各种书里七零八落看的内容，希望对大家有用。

>基因表达的定义：说到基因表达，是指RNA，还是蛋白？是指mRNA还是包括风头正旺的非编码RNA？mRNA还有不翻译的RNA呢。应该说转录水平指的是RNA水平，而蛋白应该叫翻译水平？我们这里就特指编码蛋白的mRNA的量的检测吧！

 

方法：很多很多，我们常用的也就是RT-PCR和northern。RNA没保护分析在国外很常用，也有半定量的功能，一次性试剂盒还能以此将一个表达簇一起分析，例如NFkB的转录激活谱中的8个常见基因。dot blot的最大贡献是发展到了反向dot blot的顶峰――曾经无限时髦的基因芯片，而原位杂交的放大效应和它的假阳性使它的定量（半定量，应该根本算不上定量），用它定位和用蛋白定位的意义不可同日而语，又难做，只有新发现的基因可以在没有得到蛋白和抗体的情况下进行组织或者细胞定位。

 

>先谈谈RT-PCR吧。关于原位杂交和dot blot大家可以和我论战的，我曾经看到一篇公开发表的文章把dot blot称为定量检测，是极端错误的。

 

1、模板均一性问题：愚见采用从RNA定量的方法似不妥，不要说PCR的本身的敏感度，即便是在反转录就有差异，到了cDNA的分装和用于模板的取样，这些都不能保证准确，当然在反转录阶段我们也经常控制在1或5ug，但这是为了再将来加样的时候保证大致差不多，而且尽可能地利用反转录酶，而且RNA定量本身即使用电泳也不是那么准，更不要说分光光度计，这里说一下，我曾经看到有人说用分光光度计定量，这也不是很准确，分光光度计只是掌握大概，当然用于反转录足够了，但是用于rt－pcr的定量这是不正确的，很不准的，RNA也最好至少要用电泳，一方面定量，另一方面可以看看完整性。至于用分光光度计比较不同标本之间就更不准了。

 

2、RNA制备：一般制备总RNA 即可，有时需要制备mRNA，个人认为初学者还是选择Trizol，大量制备采用传统的方法自己配，实际上和trozol一样的，有时效果还好，trizaol也就是混一混，但是优点在于质量保证，使用方便，效率高，根据不同组织用trizol一般可以提到全部RNA的50%（别小看，这已经很高了）以上，有些可以到达80%。mRNA用Qiagen的柱子，别去自己做Oligo（dT）柱，太麻烦。是否用DNAseI根据基因的特点和引物的设计，能够跨内含子的就不需要处理，处理还是很危险的哦。像这样的微量和也用不了多少次的实验，并且如果牵涉到样品是无价之宝的时候，因该选好的进口试剂。谈到RNA的贮存实际上主要是温度，至于放在TRIZOL中是不可取的，更不要说在胍里了，只－20是不够的，至少－80，液氮最保险，想想，在低温里，即使加上些RNA酶它也降解不了哇！qiagen出了一种easy产品可用于保存标本，但在常温也只是1天，所以低温才是首要的，抽的时候也是这样。

 

3、反转录：常规，取样尽量一致，如上所述，不是为了定量，是为了半定量PCR时图形的好看。选择逆转录酶根据实验需要，少量的可用Promega的一种1ug的酶，多的我们用invitrgen的5ug的II，当然有人说Promega和Roche的也不错，用过，的确可以，要不Invitrogen不像当初Gibco时那么牛了，也降价打折了。反转录成功后就不必太小心了，放在那里都可以，想想你还曾经72度灭活呢，是不是？要知道，杂合双链比DNA双链还稳定的。一般来说要扩增从反转录到PCR全过程的长达2kb以上的片断是相当困难的事，很多长基因是通过随机引物库得到的而不是通过Oligo （Td）得到的，不要说反转录,即使是PCR也是很困难的，不信可以从质粒里试试,至于反转录，就更是天方夜谭了，除了酶的效率等,还有RNA的二级结构等因素，这就要一些大公司的特殊的名贵的效果也未必好的酶了，Ｒoche和Invitrogen都有的.听天由命吧。

 

> 4、半定量RT-PCR：重点，为什么是第4条？首先说明一下，半定量PCR，我是指基于凝胶成像分析的，定量PCR指实时PCR。

实验设计：根据不同的实验，对于不同的基因要有不同的策略，还有不同的组织，选择不同的基因的转录本，选择不同的看家基因，都各自不同，对于文献不可照抄。

 

引物：对于RT－PCR重要的是引物的位置，有两种方法，一种是上下游引物设计在跨内含子的两个外显子的3’端和下一个外显子的5’端，这样不会在基因组上扩出来。第二种是我最喜欢的，设计在两个离得远的外显子上，这样从基因组和cDNA上得到得不一样，可以一引两用。以上原则对单外显子基因不使用，这是最好选择DNAaseI处理。另外，我们有一个好习惯，就是把退火温度设计成一样的，这样每次做的时候不用“三查七对”，从冰箱里拿出就坐。另外3'最后一个碱基是很重要的。

 

 

>昨天看到有人问5‘端得问题，本来以为这是大家都知道的，也在这里顺便说说，表达水平检测和开放读框没有关系，PCR的位置不需要在读框里，相反3’非翻译区反而同源性最低。而且如果用的是Oligo（ dT），用3端更保险。再说一句，我从不用软件，全靠两只眼睛看，每每用一个上午，想想还有基因组呢，只看得两眼昏花。设计好以后，最好在查一下有没有同源序列，尤其是一个家族的基因。

关于mRNA和蛋白的一致性，mRNA是不能代替蛋白水平的分析的，因为还有翻译效率和RNA降解速度的影响，当然还有蛋白的剪切和分解速度等等，但是表达水平一般来说可以大致估计一种基因的翻译产物的，有时。但二者不能混委一谈。

 

基因组问题：如上所述，可以不用处理基因组的。但是如果是单外显子呢？曾经有以为朋友问我，她的样品中总是有基因组的污染，用RNA去p总能P出来。她先用trizol过两遍，再用qiagen过两遍，还能P出来。这是很多人碰到的问题，问题的关键是TAQ（除了具有DNA指导的）还有RNA指导的DNA聚合酶功能，所以是可以直接从RNA中P出来的！那就冒险让RNA高温一下吧，只是DNAase处理时一定小心，买大公司的，保险一些，至少也应该是takara的，买液体做好的，不要自己配，比起标本来，这时候银子已经退居其次了。

 

长度：我们认为500之内比较好，不受中间可能出现的各种序列和二级结构的影响。至于eeflying说的跑的在前会弥散则可以用2％的胶就行了。我一般是250左右。目的基因和内参照之间的大小比例可以根据爱好和胶的浓度、分辨率调整的。如果是250，则相差100bp很好，如果4、500则差个200bp也可以。

 

内参照：每一次一定要做内参。不作内参的结果是不可信的，实际上我想大部分半定量RT－PCR本身就是不可信的，不过我做的是可信的，因为我反复摸，重复做，每次作内参照，跟自己对照，用不同的酶，不同的体系，作出同样的结果（基因表达结果，不是条带什么的）。

 

>不管多少样品，内参不作，等于说比较珠穆朗玛峰和泰山的高度一样，没有海拔，泰山从地面的高度和珠穆朗玛峰从青藏高原的高度没什么差别。PCR一定要同时作，但是电泳可以不一起跑，没有关系，记住，计算的是相对表达程度，再说一遍我的观点：1、半定量和定量RT-PCR做的都是基因相对表达量，不是绝对表达量，除非你能准确知道来自多少细胞，但是细胞还有死的呢。2、以电泳为基础的半定量RT-PCR本身是不可信的，作为实验的粗筛是可以的，但不能作为最终结果的，不过我的可以。3、半定量RT-PCR应该在两管中进行，除非内参基因和目的基因表达相同，长度一致，目的扩增区域的GC含量相似，或者实在穷的要省PCR管和Taq酶。

 

>解释一下：

1、同一管中不是不可以，因为它有条件现同的优点，只要目的基因的扩增量和选择的不同循环数的内参照基因的最终扩增产量大致相同就很好，很拗口吧。但是一管中的竞争抑制实在是大问题，即使对照组一致了，咱做的是差异，总有不一致的，而且PCR的放大效应会把芝麻P成西瓜的哦。在不同管中重要的模板的平均分配，这不用多说了把。2、相对和准确的问题，PCR的相对定量是因为引入了内参照，所以没有绝对定量一说，至于半定量和定量的区别不是相对和绝对的区别，而是准确和不准确的区别。一般经常搞错的定量半定量和绝对量相对量的概念，定量半定量是指检测准确度，而绝对量相对量是指基因在组织中的表达丰度，例如Northen虽然不是很准（Northern不是很好的金标准），主要是上样量的原因，不管使用28s18s定还是用SB GAPDH或者β-actin都是，但是Northern得出的是绝对组织丰度，而实时荧光定量RT-PCR虽然准确（定量）但是得出的是相对表达丰度，不管使用β-actin还是用18srRNA。至于常规的通过跑电泳的所谓“定量”RT-PCR那就远了去了。

 

另外，似乎有人认为要做的好，就要把条件摸得哈好的，一旦很好，就不更改，PCR条件，徨论Taq酶，窃以为实不足取，为何？我说的“摸”是指循环数和模板，如果连taq也要固定下来，其不是别人重复不了了？因为检测的是相对量（反复强调），所以理论上在PCR过程和成像过程只要在线性期，结果应该是差不多的，为什么不说一样是应为即使在线性期也是有差异的，大家看看文后的我们做的定量PCR的图就知道了，在每个点的切线的斜率是不同的。

 

> 关于选择什么作为内参照的问题，实际上没有定论，个人认为，18s优于actin，不要跟我说GAPDH，著名的GAPDH都可以说是肿瘤相关分子了，其它还有tubulin什么的，因该差不多，实际上actin虽然相对来说很稳定的表达量，但我想在细胞分裂的过程中，需要骨架，因此actin等本身在不同细胞，不同组织、不同时期是变化的，我想，姑妄听之。作为骨架蛋白和细胞的分裂发育是密切相关的，在不同状态表达是不同的，不同细胞等。之所以用18s是因为相对而言核糖体RNA量相对稳定，因为它的功能是同整个基因谱有关的（负责装配），更重要的（我想的）它在总RNA中占地比例高，所以更准确，就像你用某一种东西的数量去概括总量，应该选那种多的，说一座房子是由2000块砖造成的，比说用29根梁更准确吧，当然你用的是mRNA就另当别论了。

摸：一定要摸，关键是摸，摸上3、5摸总是必要的，首先分开一个一个摸，然后再放到一起摸（特指同管PCR），直到摸的好了，还要考虑比较的不同的模板中的量，这就是因为下面谈到的线性期和平台期的问题。

线性期和平台期：根据上面摸的结果，选择线性期的起始周围的循环数作为PCR指数，这和定量PCR中的原理是一样的，这相当于取线性期曲线的切线（是不是这样？）。线性期似乎因该是指数期（我想的），只是因为2的幂和倍数正好一样？不要为了后期的亮度取线性期的晚期，那样是不准的，文后复一张自备的定量RT-PCR的图参考就明白了。本来想把模板量单列的，在这里说了吧，模板量应该越多越好，当然是指在条件允许和不影响PCR体系的情况下，也不是指把20ul都加上，还要摸呢，对吧。一般来说2ul要比1ul好，很多人会问，过了一个循环不久一样了么？不一样的，这和PCR本身的原理有关，什么原理我也不懂。就像到了线性期，很多人会说，再加酶，实际上不是的，再加酶和dNTP还有引物都没用的，其实这些本身就是过量的。

>综合上面两点，说说下面一点：一般摸出来的结果是什么呢？个人认为，再使用1ugRNA反转录后用2－4ul为模板和使用5ug反转录用1－2ul为模板的情况下，一般目的基因很少超过30循环，著名的β－actin很少超过25循环，如果你看到有人用actin和sb GAPDH超过28－30循环的话，结果是不可信的，实际上即使超过25循环也是值得商榷的，肯定再RNA或者cDNA的步骤有问题，此时因该增加模板量，而不是增加循环数，即使目的基因要用30以上也要考虑一下。对于想脾脏这样的组织，actin甚至可能要低于20循环，实际上在后文谈到的凝胶成像仪的检测范围之内，应该循环数越少越好。还是那句话，并不是在指数期就可以的。

 

提示：另外，不是很亮（跑电泳时）并不代表没有到平台期，再看看我们的做的定量PCR的图就明白了，有些基因的平台期是达不到很高的（这不是因为荧光标记得影响），要看你摸的时候不同循环的扩增产物的量之间的关系，在相邻之间的差异基本复合线性增长才是线性期。

 

>一步法还是二步法：我一直不建议采用一步法，因为逆转录酶很贵，就做一次PCR，多可惜啊！还有RNA。而且反转录了之后可以做10－20次，还可以摸条件找原因。不要以为一步法是盒子，实际上是一样的，操作没有什么不同，还没办法摸条件，早该淘汰了（特指RT-PCR过程中）。对于少量的标本用1ug的反转录酶既可以了，或者用于预实验都是很好的，但是P的时候要多加一点，之所以这些话总是不确定是因为还和你正在做的基因的风度有关。

 

关于凝胶成像分析：这是常人所未想的问题（晕倒一片），一般来说基于CCD的成像系统也有这个问题，这就是CDD本身的工作原理和软件的质量，有的CCD是重复扫描的，有的软件是只有256灰阶的，所以要注意上样量不要太多，当然也不要太少（以防看不到），否则会超出扫描CCD和软件的分析范围，这和PCR到线性期就没有什么不同了。另外很多软件有手动调节，这样的软件使用时要保持每次框起来的范围的大小的一致性，不要造成太多的人为误差，号召大家不要任意修改数据。此外，紫外灯管的质量、光的强度、均一性和CCD距离、焦距、分辨率都要注意。如果有钱买冷CCD当然最好了，不过其实一般用不着。实在不行的，拍了照再扫描再用photoshop分析也未尝不可，但是那可是很不准的，中间不周太多，而且如果是热敏打印机很容易亮度饱和的，不一定会有灰阶。

 

PCR反应：常规PCR什么的，实际上Mg2 什么的没有那么重要的，退火温度什么也没有什么的。别忘了两对引物的退火温度相同哦，即使在两管中也要这样，因为在一台PCR仪上，如果在一管中，还要考虑4条引物之间不互补。

 

复孔的问题：其实用这个办法很容易解决一些判断问题，作三个复孔很好，这在定量PCR常用对吧?但是如上文所属，如果模板足够多，这步可以省去去的。

 

定量PCR：其关键在于准确和起始模板可以微量，但也只是相对定量，特指RT-PCR，这里不讨论根据标准曲线检测基因啊病毒啊什么的绝对值。为什么是准确的相对定量，我再废话一会again，是指你不知道你的模板来源是多少，所以才用GP内参，话说回来，及时你知道多少个细胞，还有细胞生死的问题对不？这就是为什么说northern是不很准确（没有定量PCR准确）的绝对定量，是因为northern的模板多，综合分光光度计和28s/18s更复合实际情况些，尤其是在不同组织分布的研究中更有效。

 

>1、 原理：毕竟，PE是定量PCR的鼻祖，而且型号也一直在推陈出新。bio－rad和roche的也是很强的，各有优势，大家还是比一比，价格、功能、性能、服务，尤其是技术支持，有些公司的技术支持强可以帮我们很多忙的。还有最近基因公司也有一种新的不错的。

 

>2、 Taqman：常见原则，方法简单，原理易懂，结果可靠。同管不同管和上面一样的，只是还多了问你的仪器有没有双波长检测滤镜，而且双波长有时在一管中也有影响。

 

>3、 仪器选择：PMT和CCD各有千秋，不要听信一家之言。能兼容96孔板和普通PCR管的最好，96控板便宜而且一致性较好，至于边缘效应实际上没有那么明显得，只要做个对照就明白了。最好能兼容各种方法、试剂和耗材的，以防后“费”无穷。速度不重要，但是其中一家公司的变性时间短也是不容小觑的优势，对整个实验速度还有TAQ酶的影响小，当然没有也没大关系，毕竟taq现在都很好。

 

>4、 结果分析：要注意不同的探针的标记效率，分开设域值线还是放在一起要根据实际情况，即目的基因和参照基因的CT值的差距，CT（还是T，很想CS嘛）的倍数也可以改的。

总结一句，（我最在行的）半定量RT-PCR一般来说基本上是g p。

 

M110或 SCS110
大多数大肠杆菌菌株中含有Dam甲基化酶和Dcm甲基化酶，前者可以在GATC序列中腺嘌呤N-6位上引入甲基，后者在CCA/TGC序列的第一个胞嘧啶 C-5位置上引入甲基。 常用的菌株都会产生dam,dcm，从而受到甲基化的影响.

部分限制性内切酶对甲基化的DNA不能切割，如FbaI和MboI等，一般生物公司提供的内切酶说明中均有说明。

大多数酶切位点的甲基化不影响切割，而有些会影响，如XbaI, BclI等。而且甲基化只发生在特定序列，以XbaI为例，只有在位点序列旁出现GA或TC，该XbaI位才会被甲基化。

而要解除这种限制修饰作用通常有两种方法：
（1）选用上述酶的同功酶，如Sau3AI，DNA识别切割位点与MboI相同；但不受甲基化影响；

（2）利用甲基化酶缺失的受体细胞进行DNA的制备，如E.coli JM110和链霉菌等，前者Dam和Dcm甲基化酶已敲出，而后者细胞内本就没有甲基化酶，从这些细胞中抽提的 DNA就能被上述酶切割。

E.coli JM110
要排除dam,dcm甲基化的影响，需要用特定的dam-,dcm-的菌株，如JM110

如果由JM110或 SCS110等甲基化缺失的菌株产生的质粒，则不会被甲基化.

各种感受态细胞的区别 用途 特征
Xl1-Blue菌株

基因型：endA1 gyrA96(nalR) thi-1 recA1 relA1 lac glnV44 F‘[Tn10 proAB+ lacIq Δ(lacZ)M15] hsdR17(rK- mK+)。
特点：具有卡那抗性、四环素抗性和氯霉素抗性。
用途：分子克隆和质粒提取。

BL21(DE3)菌株

基因型：F– ompT gal dcm lon hsdSB(rB- mB-) λ(DE3 [lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5])。
特点：该菌株用于以T7 RNA聚合酶为表达系统的高效外源基因的蛋白表达宿主。T7噬菌体RNA聚合酶基因的表达受控于λ噬菌体DE3区的lacUV5启动子，该区整合于BL21的染色体上。该菌适合于非毒性蛋白的表达。
用途：蛋白质表达。

BL21(DE3)ply菌株

基因型：F- ompT gal dcm lon hsdSB(rB- mB-) λ(DE3) pLysS(cmR)。
特点：该菌株带有pLysS，具有氯霉素抗性。此质粒还有表达T7溶菌酶的基因，T7溶菌酶能够降低目的基
因的背景表达水平，但不干扰IPTG诱导的表达。 适合于毒性蛋白和非毒性蛋白的表达。
用途：蛋白质表达

DH5α菌株

基因型：F- endA1 glnV44 thi-1 recA1 relA1 gyrA96 deoR nupG Φ80dlacZΔM15 Δ(lacZYA-argF)U169, hsdR17(rK-, λ–
特点：一种常用于质粒克隆的菌株。 其Φ80dlacZΔM15基因的表达产物与pUC载体编码的β-半乳糖苷酶氨基端实现α互补，可用于蓝白斑筛选。recA1和 endA1的突变有利于克隆DNA的稳定和高纯度质粒DNA的提取。
用途：分子克隆、质粒提取和蛋白质表达。

JM109菌株

基因型：endA1 glnV44 thi-1 relA1 gyrA96 recA1 mcrB+ Δ(lac-proAB) e14- [F‘ traD36 proAB+ lacIq lacZΔM15]hsdR17(rK-mK+)。
特点：部分抗性缺陷，适合重复基因表达, 可用于M13克隆序列测定和蓝白斑筛选。
用途：分子克隆、质粒提取和蛋白质表达。

不知道为什么，现在没有写博客的愿望了，也没有时间照顾这里了。但是刚才把以前的文章都看了一遍，发现舍不得，里面有太多的回忆了。

这里记录我的考研历程，自己给自己打气。

这里记录了我刚进实验室的日子，同时也反驳的师兄的话，我在进实验室半个月就知道了实验室不简单，处处都是是非，你怎么还老叫我孩子，看不透呢？我知道这里的矛盾，比晚进实验室的你还早

这里记录我收集的一些好玩的东西，这里还有我随性写的小诗

就这么着吧

可惜我累了，有空再写吧。今天就当翻日历了

这几天地震，我发现自己从来没有这样关注一件事情。小时候也经历了97洪水，但是没有感觉，就记得学校让拿鸡蛋给解放军送。

也许是长大了，也许是心软了，看着电视中的惨象，看着奔波的总理，我跟着他们一块掉眼泪，我甚至也想冲上去帮忙救人。

灾难，从来只会让中国人更加团结。去医院的路上，车里的电视传出一句“最新情况”，我发现全车人的目光马上都投向电视。在网上，我看到许多帖子，为灾区加油，为官兵加油，也为我们有一个好总理而感动。今天我看到一个帖子，说温总理和周总理一样，都冲到灾区第一线，那动作，那神情，我突然觉得温总理就是周总理转世。

在灾难中，有很多令人感动的事。总理一句“人民养着你们，你们看着办”。几千伞兵写下遗书去救援。医院塌了，医生在废墟边喊着同事的名字。医生在这边救援，另一边的废墟里埋着他们的亲人……感动人的地方太多太多了，我这能说，冲在第一线的人们，你们好样的

累

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0106463,北京市朝阳区左家庄
0106464,北京市朝阳区左家庄
0106465,北京市朝阳区左家庄
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0106415,北京市 三里屯
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0106354,北京市宣武区南樱桃园
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0106736,北京市朝阳区垡头
0106736,北京市朝阳区垡头
0106737,北京市朝阳区垡头
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0106799,北京市 南苑
0106796,北京市 南苑
0106797,北京市 南苑
0106798,北京市 南苑
0106799,北京市 南苑

很多人都知道可以用电影学习英语，但是并不是所有的人都从中受益的，我觉得这其中存在很多的误区。所以，今天我想把我用电影学英语的一些经验和想法写一下，大家参考一下就好。
　　
　　误区一：电影学英语很有趣。
　　错！恰恰相反，用电影学英语在大多数情况下是很痛苦的，欣赏电影和用电影学习英语绝对是两码事情，很多时候，你要不停的定格，重复，用笔作笔记，其实你会发现，这样绝对是需要很大耐心的。
　　
　　误区二：电影里出现的说法都是很实用的。
　　错！这个要看什么电影了，有些电影粗俗用语很多，比如《prison break》；有些电影又涉及太多的专业领域，比如《CSI》，都是关于侦查，破案的，还有破案用具方面的专业词汇。这些其实都不是特别有必要去记忆的。因为老外也未必知道得很清楚。
　　
　　误区三：打破砂锅问到底。
　　很多人看电影学英语，总是喜欢把每个词汇和俚语都弄得很清楚，其实我觉得这样不好，应该是挑选一些自己平时可能会用到，或者感兴趣的来学，一个人除了贵在坚持以外，一些时候该放弃的还是要放弃一些。
　　
　　误区四：电影学习花不了多少时间。
　　如果是我的话，一般都是学真人秀节目，一集大概40分钟多一点，第一遍我大概用了5个小时记笔记，之后会看了几遍。所以基本上40分钟的片子大概要消耗你7～8个小时，所以如果是一部2个小时左右的电影。我觉得你拿来一个多月来学习都是不为过的。So？你觉得电影学英语会很爽吗？我告诉你，其实挺无聊啊，而且笔记记得很痛苦。呵呵 。
　　
　　误区五：从头到尾看
　　不对，应该是切成一块一块的学。后面再详细说明吧。
　　
　　好的
　　基本上我是这样做的：
　　
　　第一：严格选材
　　我对我将要学习的电影选择是相当相当严格的。我个人在选择的时候，大概有这样些个的标准：
　　1， 生活化相当的强，片中的人物的台词，就是现实生活中外国人经常说的。这个怎么去判断呢？呵呵，其实你可以问专业人士或老外。像我就比较懒了，从来不问，因为我挑的一般都是美国，英国的真人秀节目，比如我首推《the apprentice》，为什么呢？所谓真人秀节目就是现实生活中的跟踪拍摄，根本不用去想，百分百的原味生活英语。
　　
　　2， 这个电影我要相当的喜欢看。我自己要非常非常的喜欢看这个节目，最好是我认为那种百看不厌的电影，这点还是蛮重要的，至少这样的话，可以帮助我坚持把一部电影完整的学完。
　　
　　3， 电影不能太长。可惜一般的电影都是超过1个半小时的，所以我还是喜欢挑选美国的电视节目，一般都比较短，不会超过45分钟一个小时。
　　
　　4， 完美的中英文外挂字幕。这个不是废话吗？没字幕，怎么学啊。
　　
　　第二步：
　　拿本小本子，本子上写个大标题，《XX电影》，然后准备一个自己写得顺手的笔，从头开始，记笔记吧，记什么？傻的，不要记太多的生词，关键要记句子：
　　
　　首先，记句子：
　　我在《飞黄腾达》听到一个句子：“It didn’t appear to be that threatening of an jury that occurred.” 那不是看上去的那么严重。
　　其实剧情就是讲一个人被朔料块砸了一下脑袋，她就搞得跟真的一样，旁边一个人看到以后的想法。
　　看到这种句子，要马上记下：
　　（It appears to be……of…....看上去怎么样怎么样，用of后接名字性的东西，表示补充
　　例句：It didn’t appear to be that threatening of an jury that occurred.）
　　我笔记本上就是这样记的。
　　所以，例句要很勤力地去记的，不然以后你没办法复习的。
　　
　　然后，发现的俚语要记忆
　　我在看《英国达人》的时候，裁判很喜欢说： and you just blown me away.
　　Blow sb away 震撼某人，我被你震撼了
　　同样，记下例句。
　　
　　发现不熟的用法要记：
　　《飞黄腾达》有个句子：
　　And I just had a little fuel mind game with Amy in return.
　　这里的in return 是说我通过做这件事情作为反击
　　先说一个完整的句子后面加in return，表示我做这个事情作为回报，作为反击。
　　
　　忽略的用法要记，一词多意思要记：
　　I can not for the life of me visualize Sam in that type of position.
　　“感到”这种意思，我们一般用feel，会用visualize吗？
　　所以记一下，visualize 后面括号，像这样：visualize (feel)
　　就是说，发誓以后把feel忘记，要用就用visualize，当然这其中一定有区别，关键是要自己在使用的过程中体会一下。
　　
　　好的
　　如果这样子记的话，大概要花多少时间呢？电影的话，而不是真人秀，花个15个小时是很正常的，所以一天记完一部电影的笔记，似乎是不太现实的。要有心理准备啊，其实很痛苦的。我基本上状态好的话，是5个小时一记，一集的真人秀节目应该差不多了。
　　
　　第三步：
　　拿着笔记本，读读读
　　读什么？读例句，背例句，也可以试着造自己平时常用的句子。
　　
　　第四步：
　　口语的时候，端着笔记本，尝试自己学的东西，尽自己最大的可能去用，胡编乱扯也要用。
　　
　　最后：
　　以后复习的时候呢，把片子看一遍就好了，挺方便的。
　　
　　几个要点：
　　不要从头到尾反复的看，要切段反复看。可以一段一段的学，因为如果你一口气记笔记的话，就是记得太多，没有时间去读了，不太好。
　　
　　不过，情况是这样的，具体看你的英语功力：
　　英语功力很强的话，段可以拉得很长，基础不好的话，我看最多5分钟一段就差不多了。
　　我的话，最多也就20分钟一段，有的时候很勉强，连续5个小时记笔记，就是40分钟一段，累到要死，手都记麻了。然后，记完这一天也不能做读的练习，要到明天。
　　
　　总之
　　多记句子！！
　　
　　实在觉得是很生僻的就不要去管它了，放弃。
　　
　　恩….
　　
　　还有一个很重要
　　
　　明白一件事情：
　　
　　电影学英语不是看电影
　　
　　这个绝对不是享受来的，做好痛苦和不停重复的无聊准备吧。
　　
　　呵呵，虽然也许有人不这么觉得。
　　
　　
　　当然，好消息就是：
　　我个人觉得，这样子学对于提高口语和词汇量，还有对词汇的深入应用能力，听力等综合方面都会有极大的好处，进步之快，绝对让你惊讶。
　　一般来说：
　　一部电影学完的话
　　你对英语的的感觉就会大有不同。
　　这个不是我说的
　　是以前一个上海新东方
　　我的一个老师说的